Marguerite được sắp xếp để cưới Enrique của Navarra, con trai của Juana III của Navarra, một tín đồ Tin Lành và là Nữ vương xứ Navarra. Đây là một cuộc hôn nhân được sắp đặt để thống nhất lại các mối quan hệ gia đình và để tạo ra sự hài hoà giữa các tín đồ Công giáo và nhóm Huguenot (một nhóm tín đồ Tin Lành người Pháp). Dù Nữ vương Juana III phản đối cuộc hôn nhân này, nhưng nhiều quý tộc trong triều đình của bà ủng hộ nó, và cuộc hôn nhân đã được sửa soạn. Tuy vậy, Juana III đã qua đời trước khi cuộc hôn nhân diễn ra.

Ngày 18 tháng 8 năm 1572, Vương nữ Marguerite 19 tuổi cưới Enrique của Navarra, người đã trở thành Quốc vương xứ Navarra sau khi mẹ ông qua đời. Tại đám cưới, chú rể Henry, vì là một tín đồ Tin Lành của nhóm Huguenot, đứng ngoài nhà thờ trong khi diễn ra lễ cưới. Người ta kể lại rằng trong buổi lễ, cô dâu và chú rể nhìn thẳng về phía trước mà không nhìn nhau. Khi vị Hồng y chủ tọa lễ cưới hỏi Marguerite có muốn nhận Henry làm chồng không, bà đã không trả lời; vì thế quốc vương Charles IX đã phải đặt tay lên đầu em gái mình, ấn xuống để cô gật đầu đồng ý. Henry luôn có các tình nhân trong suốt cuộc hôn nhân của mình, đáng chú ý nhất là Gabrielle d'Estrées từ năm 1591 tới năm 1599, người đã sinh cho ông ba người con.

Chỉ sáu ngày sau lễ thành hôn, Thảm sát Ngày lễ Thánh Barthélemy đã xảy ra do các tín đồ Công giáo Pháp tàn sát những người Huguenot, mà nghi vấn hàng đầu là do mẹ bà, Caterina de' Medici chủ mưu. Vụ thảm sát diễn ra với một sự tàn bạo khiến Ivan Bạo chúa của Nga cũng phải lên án.

Sau hơn 3 năm bị giam hãm tại triều đình, Henry Bourbon, đã thoát được cuộc thảm sát nhờ lời thề chuyển sang Công giáo, đã trốn khỏi Paris năm 1576, để lại Margurite. Dưới sự kiểm soát của người anh trai, Quốc vương Henri III của Pháp, Marguerite trở thành tù nhân chính thức ở chính ngôi nhà của bà. Cuối cùng, bà được phép đi theo chồng về Navarra, trong ba năm rưỡi Vương hậu Marguerite và chồng đã sống một cuộc đời đầy tai tiếng tại Pau. Cả hai đều công khai đi lại với người tình của họ, và họ thường xuyên cãi cọ với nhau.